IF免疫细胞步骤

1．免疫细胞的选择与准备

免疫细胞的选择：查看资料并结合WB检测结果，针对不同细胞对抗原的不同表达程度，选择合适的细胞株进行抗体检测。

免疫细胞的培养：针对不同细胞的生长速度，选择检测实验前的合适时间，将贴壁细胞培养在放有灭菌玻片的6孔板内，悬浮细胞培养于培养瓶内。待细胞生长良好后即可进行实验。

2．样品的稀释

将样品按1：50，1：100，1：250 ，1：500比例用PBS稀释于深孔板内并于4℃保存。如400倍稀释液检测结果阳性反应强，可按1：500，1：1000，1：2000比例进一步稀释。

3. 溶液与试剂

4%多聚甲醛，0.1%triton X-100, 10%羊血清，（以上溶剂都用1xPBS配制）抗荧光淬灭封片剂。

4. 细胞化学检测

（1）细胞实验

悬浮细胞

l收集细胞：1500rpm 离心5min收集细胞，用PH 7.0的PBST洗涤后将细胞稀释到5×106个/ml。用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。

涂片：滴加细胞悬液于画有格子的玻片上，20μl/格， 37℃温箱中干燥。

贴壁细胞

洗涤：倾出六孔板内的细胞培养液，加入PH 7.0的1XPBS，置于摇床上洗涤，反复2次，5min/次。

固定：在培养板内加入新鲜配制的4%多聚甲醛常温下固定15-30min。

洗涤：取出培养板，放置至室温。PBS洗涤2次，5min/次。

通透：加入0.1%tritonX-100（1xPBS配制），150μL/孔，室温作用10min。

洗涤：PBS洗涤2次，5min/次。

封闭：加入PBS 10倍稀释的羊血清，150μL/孔，室温放置1h。

加样：将各浓度的样品稀释液分别加入孔板内的玻片上，150μL/孔，37℃静置1h或4℃过夜。

洗涤：PBS洗涤3次，5min/次。

结合二抗：每孔中加入150μL 荧光素标记anti-Rabbit IgG （invitrogen Alexa fluor 488）（浓度1：200），室温避光放置45min。

洗涤：PBS洗涤3次，5min/次。

复染：：0.1ug/mlDAPI(用蒸馏水配制)，150μL/孔，复染5min。

洗涤：PBS洗涤3次，5min/次，用蒸馏水清洗一次。

封片：滤纸稍稍吸干后，用抗淬灭剂封片，立即观察。

注意：在实验过程中，要添加空白、阴性对照，以便能及时发现、分析并解决问题。