WB操作步骤

1. 一孔梳子膜裁条后的预处理

PVDF膜用100%甲醇浸泡20-30s，后用蒸馏水清洗4-5次，以去除甲醇。

2. 预处理的PVDF膜，倒去最后一遍蒸馏水后，直接放入含有 2-5%脱脂奶粉的 TBST中（脱脂奶粉要充分溶解在TBST中，不能有奶粉颗粒存在。判断方法：倒一些到少量水中，看看是不是溶液状态还是有细小的未溶解奶粉颗粒）。封闭时间：室温1h或4℃过夜封闭。封闭时摇床转速不要太快，以液面微微有晃动为准。

3. 封闭结束后，用TBST清洗3次，每次10min。摇床转速要让液面有明显晃动。

4. 清洗后，室温孵育一抗 1h。一抗提前用含有2-5%脱脂奶粉的TBST稀释好。

5. 一抗抚育后，用TBST清洗3次，每次10min。摇床转速要让液面有明显晃动。

6. 清洗后直接孵育二抗，室温孵育二抗 1h。 二抗提前用含有2-5%脱脂奶粉的TBST稀释好。

7. 二抗抚育后，用TBST清洗3次，每次10min。摇床转速要让液面有明显晃动。

8. 清洗后的膜放在曝光板上，去除多余的TBST液体，但不要膜变干。加上化学发光底物（底物的A液和B液要在室温放置几分钟， 之后再混合A液和B液）。底物在膜上反应3min后，吸掉多余的底物。在膜上盖上玻璃纸后，进入暗室曝光。曝光时间：3min，1min，30s，10s，5s。

注：磷酸化抗体可以考虑用1-5% BSA TBST代替脱脂奶粉TBST。

TBST配方

1×TBST的终浓度为Tris:0.02mol/L ， Nacl:0.1mol/L ，吐温-20：0.1% ，pH值为7.4。