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细胞冻存、复苏及计数存活测试

  一般来说,细胞进行转移,最佳的策略是进行低温保存(-70℃~-196℃),而细胞深低温保存的基本原理是:在-70℃以下时,细胞内的酶活性均已停止,即代谢处于完全停止状态,故而可以长期保存。细胞低温保存的关键,在于通过0~20℃阶段的处理过程,在此温度范围内,冰晶呈针状,极易招致细胞的严重损伤。

  经过前人的长期试验,发现细胞的冻存及复苏基本原则是慢冻速融,这样可以最大限度的保存细胞活力。


材料准备

1、仪器:净化工作台、离心机、恒温水浴箱、冰箱(4℃、-20℃、-70℃)、倒置相差显微镜、培养箱、液氮冰箱。

2、玻璃器皿:吸管(弯头、直头)、培养瓶、玻璃瓶(250ml、100ml)、废液缸。

3、塑料器皿:吸头、枪头、胶塞、移液管(10ml)、15ml离心管、冻存管(1~2ml)。

4、其他物品:微量加样枪、红血球计数板、记号笔、医用橡皮膏、移液枪。

5、试剂:PBS,胎牛血清,DMSO,培养液,双抗,胰蛋白酶(0.25%)。


细胞冻存

  目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂,这两种物质能提高细胞膜对水的通透性,加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外,减少细胞内冰晶的形成,从而减少由冰晶形成的细胞损伤。

1、10%的DMSO+90%胎牛血清。甘油一般用于菌种保存很少用于细胞冻存。

2、取对数生长期的细胞,用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来,悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中。

3、离心1000 rpm,5 min。

4、去除胰蛋白酶及旧的培养液,加入适量配制好的冻存培养液,用吸管轻轻吹打使细胞均匀,计数,调节冻存液中细胞的最终密度为5x10^6/ml~1x10^7/ml。

5、 在冻存管上标明细胞的名称,冻存时间及操作者。

6、冻存:标准的冻存程序为降温速率-1~-2℃/min;当温度达到-25℃以下时,可增至-5℃~-10℃/min;到-100℃时,则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h,然后放入-70℃冰箱中过夜,取出冻存管,移入液氮容器内。


细胞复苏

1、从液氮容器中取出冻存管,直接浸入37℃温水中,并不时摇动令其尽快融化。

2、从37℃水浴中取出冻存管,打开盖子,用吸管吸出细胞悬液,加到离心管并滴加10倍以上培养液,混匀。

3、离心,1000 rpm,5 min。

4、弃去上层清液,加入含10%胎牛血清培养液重悬细胞,计数,调整细胞密度,接种培养瓶,37℃培养箱静置培养。

5、次日更换一次培养液,继续培养。


细胞计数及存活测试

1、原理:

(1)计算细胞数目可用血球计数盘或是Coultercounter粒子计数器自动计数。

(2)血球计数盘一般有二个chambers,每个chamber中细刻9个1mm2大正方形,其中4个角落之正方形再细刻16个小格,深度均为0.1mm。当chamber上方盖上盖玻片后,每个大正方形之体积为1mm2×0.1mm=1.0x10-4ml。使用时,计数每个大正方形内之细胞数目,乘以稀释倍数,再乘以104,即为每ml中之细胞数目。

(3)存活测试之步骤为dyeexclusion,利用染料会渗入死细胞中而呈色,而活细胞因细胞膜完整,染料无法渗入而不会呈色。一般使用蓝色之trypan blue染料,如果细胞不易吸收trypan blue,则用红色之Erythrosin bluish。计算细胞活率:活细胞数/(活细胞数+死细胞数)×100%。计数应在台盼兰染色后数分钟内完成,随时间延长,部分活细胞也开始摄取染料;因为台盼兰对蛋白质有很强的亲和力,用不含血清的稀释液,可以使染色计数更为准确。

2、材料:

0.4%w/v trypan blue;Erythosin bluish stain;取0.1gram Erythrosin bluish、0.05gram preservative methyl paraben溶于100mlCa++/Mg++freesaline;血球计数盘及盖玻片(Hemocytometerandcoverslip);计数器(counter);低倍倒立显微镜;粒子计数器(Coultercounter,CoulterElectronics)。白细胞稀释液(4%乙酸溶液)。

3、步骤:

(1)取50μl细胞悬浮液与50μl trypan blue(orErythrosinbluish)等体积混合均匀于1.5ml小离心管中。

(2)取少许混合液(约15μl)自血球计数盘chamber上方凹槽加入,盖上盖玻片,于100倍倒立显微镜下观察,活细胞不染色,死细胞则为蓝色(或红色-Erythrosin bluish)。

(3)计数四个大方格之细胞总数,再除4,乘以稀释倍数(至少乘以2,因与trypanblue等体积混合),最后乘以104,即为每ml中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线上,只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞)。

注:4大格细胞总数×稀释倍数×10 4/4=细胞数/ml

每一大格的体积=2.5px×2.5px×0.25px=10-4ml

  计数板计数时,最适浓度为5~10×10 5细胞/ml,此范围外计数误差偏大。高浓度细胞悬液,可取出部分作稀释或连续稀释后计数。


★注意要点

1、冷冻越慢越好,复苏越快越好。

2、与液氮接触的操作,注意戴保护眼镜和手套。细胞复苏时,水浴中摇动小瓶易爆炸。且DMSO为有毒致癌品,接触时带好手套。

3、冻存细胞数量要足够,一般最低要达到5x10^6/ml。浓度视情况而定。

4、做好标记:培养瓶上应该用马克笔做好标记,写上细胞名称、代数和冻存时间。

5、对刚复苏的细胞动作要轻柔,避免细胞破裂。

6、DMSO对大多数细胞不敏感,所以解冻之后不需要除去DMSO,解冻后频繁换液会慢慢除去DMSO。部分对DMSO敏感的细胞需要除去DMSO。

7、解冻后的细胞要用和以前一样的培养液和血清,突然换不一样的培养液和血清会造成细胞生长不良,甚至死亡。


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