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新闻详情

新魔剪“Cas13a”可编辑RNA

2016年6月,Broad研究所的张锋获得了一项重要成果。在一篇Science论文中,他带领的团队首次描述了一种RNA靶向的CRISPR酶——C2c2(现在被称为 Cas13a)。与CRISPR/Cas9切割DNA的活性不同,CRISPR/Cas13a能够用于切割细菌细胞中特定的RNA序列。

这篇论文发表后,CRISPR/Cas13a成了很多科研团队的“新宠”。仅仅3个月,CRISPR先驱、加州大学伯克利分校的Jennifer Doudna教授就在Nature杂志上发表一篇论文,证实CRISPR/Cas13a能够用于RNA检测。


今年4月,张锋团队又发表一篇Science论文。研究描述了CRISPR/Cas13a如何“变身”高度灵敏的“探测器”:能够指示出目标RNA或DNA分子中单分子的存在。这一新工具被研究者们授予了SHERLOCK(神探夏洛克)的称号。他们认为,有一天,这一技术可能被用于应对病毒和细菌爆发、监测抗生素耐药性以及检测癌症。这些研究进展有力证实了CRISPR/Cas13a多种不同方向的应用前景。然而,正如最初科学家们在发现CRISPR/Cas9的基因编辑功能后,第一时间想证实其能否用于哺乳动物细胞一样,张锋团队一直在探索CRISPR/Cas13a能否在这类细胞中发挥作用。

Cas13a bound to and cleaving single-stranded RNA.STEPHEN DIXON

10月4日,张锋等最新发表在Nature杂志的一篇论文首次明确回答的了这一问题。研究证实,CRISPR/Cas13a能够在哺乳动物细胞中“工作”,即,特异性地下调内源性和报告RNAs的水平。


研究中,科学家们测试了来自15种不同微生物的Cas13酶,最终找到了最“符合心意”的一个——来自Leptotrichia wadei的LwaCas13a。利用LwaCas13a使得研究者们能够以比当前的RNA敲低工具(RNA干扰,RNAi)更强的特异性在目标RNA上切割特定的位点。研究人员称,尽管RNAi是一种有用的工具,但它经常导致研究人员不想要的“脱靶效应”(即,没有作用于预想的位置),而LwaCas13a显著降低了这种脱靶效应。

张锋团队制作了一个双质粒RNA靶向CRISPR系统:

a.表达导向RNA(guide RNA)质粒;

b.表达Cas13a基因的质粒;

研究结果显示,CRISPR-Cas13a有效地编辑了转录自一个报告质粒以及人类细胞中3个内源性基因的RNA。


此外,该研究中,张锋团队还找到了一种所谓的Cas13“死亡变体”。这种Cas13变体能够结合目标RNA,但不能发挥切割作用。通过结合明亮的荧光标记,该版本的Cas13能够被用于追踪目标RNA的“轨迹”。

Cas13a molecule PDB ID 5WTJ, RNA molecule PDB ID 5LYU; composition by Lauren Solomon

值得一提的是,在这项研究中,科学家们还有一个意外的收获。此前,张锋团队曾证实,在细菌中,在切割了目标RNA后,Cas13a还会继续切割非目标RNA。那么,在哺乳动物细胞中,Cas13a是否也是同样如此呢?


利用RNA测序,研究人员证实,不同于在细菌中的作用方式,在人类细胞系中,Cas13a只会靶向由导向RNA指定的RNA,从而让细胞内其它的RNA序列保持完整。这是非常令人惊讶以及令人困惑的结果。为什么在人类细胞中,Cas13a非特异性的RNA切割功能没有“生效”呢?这一问题还需进一步解答。

该研究的共同第一作者、张锋的研究生Omar Abudayyeh说:“尽管我们已经有了很好的工具来删除基因,但这些工具仍然有很多限制,使得研究基因的功能非常困难。Cas13能够让我们降低基因表达的水平,而不是完全消除这些基因。这一改变对于研究基因,以及开发纠正基因疾病更低毒的疗法是非常有帮助的。”


Broad研究所官网的报道称,证实CRISPR-Cas13a能够在哺乳动物细胞中安全、有效地“工作”是利用该系统研究人类生物学和疾病的非常关键的一步。CRISPR-Cas13a为学习细胞功能,以及设计更安全的疗法带来了新的机会。

参考文献:

【1】A Programmable Dual-RNA–Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity

【2】C2c2 is a single-componentprogrammable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector

【3】Two distinct RNase activitiesof CRISPR-C2c2 enable guide-RNA processing and RNA detection

【4】Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2

【5】RNA targeting with CRISPR–Cas13

【6】New CRISPR tool targets RNA in mammalian cells

【7】CRISPR System Targets RNA in MammalianCells

 此 处 插 播 一 则 广 告

 细胞污染处理产品使用方法

①  Nocard Rid(支原体去除剂):

(1)将Nocard Rid与完全培养液按1:800~1000比例稀释,加入细胞正常培养;

(2)根据细胞污染的严重程度,处理3~6次即可完全清除细胞支原体污染问题。

② MycoTest Kit(支原体检测试剂盒)

MycoTest Kit是利用降落聚合酶链式反应技术(TD-PCR)对支原体16S rRNA 基因高度保守区域特异性片段进行扩增检测。该方法灵敏度高,特异性强,可用于各种生物材料(如细胞培养基、实验动物分泌物、动物血清等)支原体感染的检测。

Nabact Rid(黑胶虫去除剂):

在细胞培养的时候,有时会在400倍显微镜下看到小黑点在动,小黑点有时呈点状,有时呈小的片状,运动形式为在原地振动(类似布朗运动),这就是黑胶虫。

(1)推荐Nabact Rid的稀释比例为1:500,例如:5 mL培养基加入10 μL的Nabact Rid;

(2)弃去旧的培养基,用PBS将细胞清洗干净,再加入新鲜的含有Nabact Rid的培养基,2天1次,连续处理3个周期。

 Candida Rid(念珠菌清除剂):

Candida Rid 通过特异性的破坏真菌细胞壁的结构,让真菌细胞失去固有形态及完整性,从而影响念珠菌属的正常代谢、离子交换和渗透压,让细胞彻底摆脱念珠菌的困扰,确保细胞的健康生长。

(1) 用PBS冲洗细胞3~5次,每次都从一个方向冲洗倒掉;

(2)推荐将Candida Rid与完全培养液按1:500比例稀释,加入细胞正常培养;

⑤ Paebacl Rid(杆菌去除剂):

类芽孢杆菌(Paenibacillus Ash,Priest&Collin,1994)呈杆状,革兰氏染色阳性、阴性或可变,以周生鞭毛运动。当细胞出现类芽孢杆菌污染,会在显微镜下看到一些杆状游动的小虫子,对各种抗生素都有很强的耐药性,很难清除,且增殖很快跟细胞竞争营养,培养液不会变混浊。

(1)发现细胞有类芽孢杆菌污染,弃掉培养基,用pbs清洗3遍;

(2)然后按1:1000 比例加入Paebacl Rid 试剂,即:边加边摇匀;

(3)每天处理一次,Paebacl Rid 连续处理三天,即可完全清除类芽孢杆菌污染。

Cell+_细胞房除菌剂:

(1)在细胞房及实验室空间,喷两层层即可快速杀灭常见污染源;

(2)喷洒本品后,需将细胞房或实验室密闭10-20min后使用。

Cell+_培养箱除菌剂:

(1)在CO2培养箱内壁及空间,喷三层即可快速杀灭常见污染源,也可对环境空气灭菌;

(2)经试验验证,处理培养箱污染对常见细胞培养无任何影响,无需将细胞移出培养箱;

(3)建议CO2培养箱每1-2周处理一次。

Cell+_水盘抑菌剂:

(1)首次使用,请先将培养箱水盘清洗干净,然后推荐使用培养箱除菌剂(NZF602)或75%酒精擦拭;最后按照1:100的比例向水盘中加入水盘抑菌剂处理过的水(即:1L水加入10 mL水盘抑菌剂);

(2)再次使用,可直接按照1:100的比例向水盘中加入本品,每7-10天处理一次。

Cell+_水浴锅抑菌剂:

(1)直接按照1:1000的比例向水浴锅中加入本品,每7-10天处理一次。

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